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Artículo Original

IgE sérica e IgA salival, total y específica para Dermatophagoides pteronyssinus y subpoblaciones leucocitarias en niños atópicos y no atópicos con asma y/o rinitis

Horacio M Serra, Stefanía Santo, María I Pereira, Pablo Romero, Adriana Cassinerio, Telma Varela, Omar Romero, Julio Orellana

ARCHIVOS DE ALERGIA E INMUNOLOGÍA CLÍNICA 2016;(03):0095-0105 


Objetivo. Investigar inmunológicamente niños con problemas respiratorios de asma y/o rinitis (atópicos o no atópicos) en la búsqueda de evidencias que permitan una mejor comprensión del desbalance que padecen estos niños en su sistema inmune.
Materiales y métodos. Se estudiaron 47 niños de ambos sexos, con edades comprendidas entre los 6 y 15 años, que concurrieron a la consulta por afecciones respiratorias compatibles con asma y/o rinitis a la División de Alergia e Inmunología del Hospital de Niños de la Santísima Trinidad de la Ciudad de Córdoba. Según la información obtenida en la anamnesis, examen físico y prick tests, fueron divididos en dos grupos: atópicos (n=25) y no atópicos (n=22). Luego que los padres firmaron el consentimiento informado y los niños mayores a 7 años dieron su asentimiento para participar del trabajo de investigación, se tomaron muestras de sangre y saliva, para determinar concentración y actividad específica en inmunoglobulinas (Igs) así como estudiar poblaciones leucocitarias y subpoblaciones linfocitarias.
Resultados. Como era previsible, los niveles de IgE sérica total y los porcentajes relativos de eosinófilos sanguíneos se mostraron significativamente elevados en el grupo de los niños atópicos (A) con respecto a los no atópicos (NA). El estudio de IgE sérica específica para Dermatophagoides pteronyssinus solo arrojó resultados positivos en los pacientes A y se observó una correlación significativa entre los niveles de IgE total y específica para dicho alérgeno, y entre los niveles de prick y RAST. Los niveles séricos de IgG e IgA no demostraron diferencias de significación entre ambos grupos. El estudio de la IgA salival (IgAs) total permitió observar en el grupo de los niños NA concentraciones significativamente mayores que las correspondientes al grupo de pacientes A. Sin embargo, al estudiar la IgAs específica para el D. pteronyssinus, se observó lo inverso: los pacientes A tienen casi el doble de IgAs específica para el alérgeno respecto del grupo NA. En el estudio de subpoblaciones de células T (CD3, CD4 y CD8), no se observaron diferencias significativas entre ambos grupos. Las subpoblaciones de linfocitos B CD27-y linfocitos B CD27+ tuvieron valores similares en ambos grupos (aproximadamente 80% y 20%, respectivamente). En ambos grupos, alrededor de un 50% de los linfocitos B CD27+ expresaron IgD y el 50% restante fueron IgD–. Sin embargo, el grupo de niños A tuvo dos veces menos de linfocitos B que expresan alta densidad de la molécula CD27 (CD27+++) con respecto a los niños NA (p=0,044). Conclusión. Entre los parámetros inmunológicos investigados encontramos diferencias significativas entre niños A y NA en las concentraciones totales y específicas para el D. pteronyssinus en los isotipos de IgE e IgAs, y en una subpoblación de linfocitos B CD27+++. Dichos hallazgos son analizados en la discusión del manuscrito.


Palabras clave: hipersensibilidad, atopia, asma, rinitis, IgE, IgA salival, linfocitos B,

Purpose. To perform an immunologically investigation in children with respiratory problems of asthma and/or rhinitis (atopic or non atopic) in order to get a better understanding of the immune system imbalance in these patients.
Materials and methods. 47 children of both sexes, aged between 6 and 15 years, who were attended for respiratory diseases at the Division of Allergy and Immunology at Children's Hospital de la Santísima Trinidad from Córdoba city were studied. According to information obtained on clinical history, physical examination and prick tests they were divided into two groups: Atopics (n=25) and non-atopic (n=22). After parents signed informed consent and children over 7 years assent to participate in the research work, samples of blood and saliva were taken to determine immune globulins concentrations and specific activities as well as to study leukocyte populations and lymphocytes subpopulations.
Results. As expected, levels of total serum IgE and the relative percentages of blood eosinophils were significantly higher in the group of atopic (A) children with regard to non¬atopic (NA) children. The study of specific serum IgE for Dermatophagoides pteronissynus only showed positive results in the A group, and positive correlations between the levels of total and specific IgE, as well as prick and RAST values. Serum IgG and IgA levels showed no significant differences between both groups. Total salivary IgA concentrations were significantly higher in the group of NA children than in the group of A patients. Surprisingly, when specific salivary IgA for D. pteronyssinus was studied, the opposite was observed: Atopic patients have nearly twice specific salivary IgA for this allergen than the NA children.
In the study of T cells subpopulations (CD3, CD4 and CD8), no significant differences between groups were observed. The subpopulations of CD27-B cells and CD27+ B cells were similar in both groups (roughly 80% and 20%, respectively). In both groups, approximately 50% of CD27+ B cells expressed IgD and the remaining 50% were IgD–. However, atopic children had less than half B cells expressing high density of CD27 molecule (CD27+++) with respect to the NA children (p=0.044).
Conclusion: Among the immunological parameters investigated, we found significant differences between A and NA children in the concentrations of total and specific IgE and salivary IgA to the allergen, and in a subpopulation of CD27+++ B cells. These findings are debated in the discussion of the manuscript.


Keywords: hypersensitivity, atopy, asthma, rhinitis, IgE, salivary IgA, B lymphocytes,


Los autores declaran no poseer conflictos de intereses. Premio AAAeIC al mejor trabajo en Investigación Clínica en Alergia. XXXVIII Congreso de Alergia e Inmunología Clínica. Asociación Argentina de Alergia e Inmunología Clínica

Fuente de información Asociación Argentina de Alergia e Inmunología Clínica. Para solicitudes de reimpresión a Archivos de Alergia e Inmunología Clínica hacer click aquí.

Recibido 07/2015 | Aceptado 08/2015 | Publicado 11/2015

Tabla 1. Poblaciones leucocitarias en ambos grupos (no atópicos y atópicos).
Tabla 2. Subpoblaciones linfocitarias en ambos grupo (no atópicos y atópicos).
Figura 1. Resultados de prick test para Dermatophagoides pteronyssinus en ambos grupos de pacientes.
Tabla 3. Subpoblaciones de linfocitos B en ambos grupos (no atópicos y atópicos).
Figura 2. Concentraciones de inmunoglobulinas séricas en ambos grupos de pacientes. A (IgG), B (IgA).

Figura 3. Correlación entre niveles de IgE total e IgE específica para Dermatophagoides pteronyssinus en pacientes pertenecientes al grupo atópico.
Figura 5. (A) Porcentaje de linfocitos B CD19+/IgD–/CD27+ [R2] en un individuo representativo del grupo no atópico. (B) Porcentaje de linfocitos B CD19+/IgD–/CD27+ [R2] en un individuo representativo del grupo atópico.

Introducción

 

El término rinitis se utiliza para describir a un grupo heterogéneo de trastornos nasales caracterizado por uno o más de los siguientes síntomas clínicos: congestión nasal, rinorrea, prurito nasal y estornudos. El asma es una condición clínica compleja y heterogénea, en donde participan múltiples factores genéticos y ambientales, que conducen a la tríada patológica de obstrucción intermitente y reversible de las vías respiratorias, inflamación bronquial crónica con infiltrado leucocitario e hipertrofia de las células del músculo liso bronquial e hiperrreactividad a los broncoconstrictores1-4.

Estudios previos realizados en el mundo desarrollado han demostrado fehacientemente un claro aumento de las tasas de incidencia del asma durante la segunda mitad del siglo XX 5,6. En todos los casos el aumento de asma y sensibilización alérgica se correlacionó con mejoras en las condiciones de vida (prosperidad) de los grupos poblacionales estudiados. Otras investigaciones han aportado nuevas evidencias de que probablemente el aumento de los pacientes con asma se debe a uno o más cambios ambientales operando en un subconjunto genéticamente predispuesto de la población7,8.

En el año 2001, la revista Allergy publicó un position paper sobre nomenclatura alérgica, trabajo que fue encargado por la European Academy of Allergology and Clinical Immunology a un grupo de profesionales especialistas en esta disciplina médica9. En dicho documento se define el término hipersensibilidad como un conjunto de síntomas y signos reproducibles, iniciados por la exposición a un estímulo definido y a una dosis tolerada en individuos normales. El término alergia se define como una reacción de hipersensibilidad iniciada por mecanismos inmunológicos, y el término atopia como una reacción de hipersensibilidad alérgica en donde participan mecanismos inmunológicos tales como linfocitos Th2 productores de IL-4, IgE específicas para alérgenos, células cebadas, eosinófilos y productos liberados por dichas células. Basándonos en esta terminología utilizaremos de ahora en adelante términos como asma/rinitis atópicos y asma/rinitis no atópicos.

Los conocimientos sobre patogenia y fisiopatología del asma y la rinitis resultan de estudios en humanos y de modelos animales, pero es necesaria cierta cautela en la extrapolación a partir de datos obtenidos en estos modelos experimentales para tratar de entender lo que está sucediendo en estas dos patologías. El asma y la rinitis son procesos inflamatorios iniciados por diferentes moléculas (inocuas y/o nocivas para el epitelio respiratorio) que inducen la liberación de citocinas tales como IL-33, IL-25 y TSLP, las cuales son capaces de promover el desarrollo de Th2 específicos de alérgenos altamente polarizadas19. Estos linfocitos, productores de grandes cantidades de IL-4, IL-5 e IL-13, juntamente con moléculas liberadas por células cebadas y eosinófilos dañan las mucosas de las vías respiratorias11-14.

Evidencias más reciente sugieren que otros tipos celulares también contribuyen al desarrollo de estos procesos inflamatorios: células linfoides innatas tipo II15,16, células dendríticas17, células Th1718-21 y distintos tipos de células T reguladoras22,23.

Independientemente de la causa y/o niveles de gravedad, los pacientes pueden experimentar exacerbaciones agudas, a menudo en asociación con infecciones respiratorias producidas por ciertos virus24. Recientemente se han obtenido evidencias de que el virus influenza puede promover hiperreactividad de vías aéreas independientemente del sistema inmune adaptativo, mediante la inducción de IL-33 que activa células linfoides innatas productoras de IL-13 con efectos directos sobre células del epitelio respiratorio y musculares lisas25. El virus respiratorio sincitial puede inducir la expresión y bioactividad de indolamina 2,3-dioxigenasa por células dendríticas, enzima que induce la apoptosis selectiva de linfocitos Th1 y contribuye a respuesta inmune sesgada a un perfil Th226.

El asma habitualmente comienza en la infancia o durante la adolescencia. Muchos niños que han tenido eccema o alergia digestiva en la infancia, seguido de rinitis (fenotipo atópico) terminan desarrollando asma, lo que es conocido como la marcha alérgica. Parecería que el fenotipo atópico se hereda de manera diferente que la tendencia al asma. Si bien las rinitis más comunes son las atópicas, también hay numerosos casos de rinitis no atópicas (infecciosa, hormonal, por drogas o alimentos, etc.). Alrededor de un 70% de casos de asma está asociado con individuos atópicos, pero la sensibilización atópica no es esencial ni suficiente para el desarrollo de esta condición patológica. En el 30% restante de los pacientes, el asma puede no estar asociada con IgE y puede ser desencadenada por diferentes estímulos no inmunológicos.

El objetivo de nuestro trabajo fue investigar las concentraciones de inmunoglobulinas séricas y salivales (totales y específicas para Dermatophagoides pteronyssinus) y el perfil de subpoblaciones linfocitarias circulantes en dos grupos: uno de niños atópicos (A) con asma/rinitis, no sometidos a inmunoterapia, y otro con una clínica similar pero sin evidencias de enfermedad atópica (NA).

 

Materiales y métodos

 

Tipo de estudio

Investigación transversal sobre parámetros inmunológicos en dos grupos de niños con rinitis/asma. Un grupo que según la anamnesis, examen físico y prick test para alérgenos inhalantes fue clasificado como grupo A, monosensibilizado a D. pteronyssinus (atópico); y otro grupo que luego de similar examen y con tests cutáneos negativos para todos los alérgenos inhalantes estudiados fue considerado como NA.

 

Comité de Ética y consentimiento informado

Este estudio de investigación fue aprobado por el Comité de Ética del Polo Sanitario del Niño y del Adulto, y registrado en el Registro Provincial de Investigación en Salud (RePIS) con el Nº 1183. El estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki. Se solicitó consentimiento informado a los padres y asentimiento a los niños mayores de 7 años.

 

Pacientes

Niños de ambos sexos, de 6 a 15 años de edad, de igual condición social en la ciudad de Córdoba que concurrieron a la División de Alergia e Inmunología Clínica del Hospital de Niños de la Santísima Trinidad de la ciudad de Córdoba y consultaron con síntomas compatibles de enfermedad alérgica respiratoria (rinitis/asma). Todos fueron evaluados clínicamente (examen físico y anamnesis) para descartar otras patologías y ninguno estaba con tratamiento inmunológico (esteroides sistémicos y/o inhalatorios, inmunosupresores, inmunoterapia específica) previo o al momento de la consulta y de la realización de los estudios in vivo e in vitro.

 

Evaluación clínica y diagnóstico

Se realizó anamnesis, examen físico y prick tests para D. pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Alternaria, Chaetomium, Cladospodium y Fusarium, controles con solución salina e histamina glicerinada con kit de Allergo Pharma en cara anterior del antebrazo como ha sido previamente descripto27. Como resultado de estos estudios los pacientes fueron divididos en dos grupos: el grupo atópico tuvo n=25 (15 varones, 10 mujeres) y el grupo no atópico tuvo n=22 (12 varones, 10 mujeres).

 

Muestras biológicas

Se obtuvieron diferentes muestras biológicas (sangre entera, suero y saliva) el mismo día de cada niño que participó de esta investigación, luego de comprobar ausencia de cuadro febril, resfrío e infecciones.

• Sangre entera: se extrajo, por punción venosa, 1 ml de sangre a la cual se adicionó 20 µl de anticoagulante EDTA tripotásico.

• Suero: se obtuvo a partir de sangre venosa recogida sin anticoagulante y centrifugada a 3500 rpm por 5 minutos. El suero fue extraído, colocado en tubo eppendorf y conservado en un freezer de –80 ºC hasta su uso.

• Saliva: la recolección de la muestra de saliva se realizó por la mañana antes de la extracción de sangre. El paciente debió cumplir con las indicaciones de no comer dos horas antes de la toma de muestra y no realizar el lavado de dientes esa mañana. Se utilizó el método de goteo pasivo que ha sido previamente descripto28. De manera resumida, la muestra fue recolectada de la siguiente manera: se le pidió al paciente que trague saliva para vaciar la boca, y luego de permanecer en reposo con los ojos abiertos y la cabeza ligeramente inclinada hacia delante durante 2 minutos sin tragar, la saliva fue recolectada en un recipiente, transferida a un tubo eppendorf, centrifugada a 2000 rpm por 10 minutos, y conservada en un freezer de –80 ºC hasta su uso.

 

Estudios in vitro

• Determinación de poblaciones leucocitarias: el recuento de glóbulos blancos se realizó a partir de sangre entera utilizando un contador hematológico Sysmex XT 2000i.

• Determinación de subpoblaciones linfocitarias en sangre periférica: para el estudio de subpoblaciones linfocitarias T y B (porcentajes y valores absolutos) se utilizaron anticuerpos monoclonales (Acm) marcados con diferentes fluorocromos, citometría de flujo (FACS) con un Citómetro Coulter Epics XL, programa System II, y una Plataforma Dual o Múltiple (CDC 1997). Se utilizó la siguiente combinación de Acm (combinación de 3 marcadores por tubo) para cada individuo: Tubo 1: control de autoflorescencia; Tubo 2: CD8 (FITC)/CD4 (PE)/CD3 (PCy5) (Trichrome, CoulterImmunotech); Tubo 3: IgD (FITC)/CD27 (PE)/CD19 (PCy5) (CoulterImmunotech). En tubos de citómetro se incubaron 100 µl de sangre con los Acm durante 15 min a temperatura ambiente y en oscuridad, luego se lisaron los glóbulos rojos con ClNH4 durante 15 min a temperatura ambiente y en oscuridad; y finalmente los tubos fueron analizados en el citómetro. Se identificaron los linfocitos de acuerdo con su posición en un gráfico de tamaño (forward scatter [FS]) versus granularidad (side scatter [SS]). Se contaron 5000 elementos en la ventana (gate) de linfocitos o de linfocitos B (CD19+). El recuento celular se expresó en valores absolutos y porcentajes. Se identificaron fenotípicamente las siguientes poblaciones celulares: Linfocitos T (CD3+/CD19-), linfocitos T cooperadores (CD3+/CD4+), linfocitos T citotóxicos/supresores (CD3+/CD8+), linfocitos B (CD3/CD19+), linfocitos B CD19+/IgD+/CD27, linfocitos B CD19+/IgD+/CD27+, linfocitos B CD19+/IgD/CD27+, y linfocitos B CD19+/IgD/CD27+++.

 

Cuantificación de inmunoglobulinas

séricas

• IgG e IgA: se utilizó la técnica de IDRS29. Para confeccionar las placas se preparó una solución madre de agar (Noble Sigma) al 3% en agua destilada. En el momento del estudio se la mezcló en partes iguales con solución fisiológica y luego de llevarla en baño termostatizado a una temperatura de 56 ºC se agregó el antisuero monoespecífico (International Immunology Co. CA, USA) en una dilución apropiada, habitualmente entre 1/100 a 1/200. Inmediatamente 3 ml de esta mezcla se depositaron sobre una placa de vidrio de 2,5 × 7,5 cm previamente ubicada en situación de perfecta horizontalidad. Luego de gelificar se mantuvo en heladera durante una hora. Los reservorios de siembra se efectuaron con sacabocado metálico de 4 mm de diámetro. Se sembraron como testigos 3 diluciones de estándares de concentraciones conocidas (Rockland, PA, USA). Las muestras en estudio fueron apropiadamente diluidas y sembradas con micropipeta Hamilton de 5 µl. Se dejó migrar en cámara húmeda durante 48 horas a temperatura ambiente y luego con lupa milimetrada se registraron los diámetros de los halos de precipitación. Con las lecturas del Standard se efectuó en papel milimetrado un gráfico de diámetro al cuadrado en función de la concentración expresada en mg%, las lecturas de los diámetros de las muestras problemas fueron llevadas a esta gráfica y por extrapolación se determinó su concentración.

• IgE sérica total: se utilizó la técnica de Total IgE IRMA (Siemens Healthcare Diagnostics, CA, USA). En tubos de plástico con anticuerpo monoclonal anti-IgE adosado a sus paredes, se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, diluciones apropiadas de estándares de IgE y sueros problema. Luego de 3 lavados y perfecto escurrimiento por inversión, se agregó antisuero monoclonal anti-IgE marcado con yodo 125 y se incubó durante 24 hs en heladera. Luego de repetir la serie de lavados y escurrimiento, se efectuaron las lecturas de la radiactividad expresadas en cpm en un contador gamma (contador de pozo Alfa Nuclear). Con las lecturas de los estándares de IgE de concentración conocida se efectuó en papel semilogarítmico una curva de las cpm obtenidas, expresadas como un porcentaje de la radiactividad total, en función de la concentración de IgE. Las lecturas de las muestras problema fueron referidas a la gráfica y por extrapolación se determinó su concentración de IgE expresada en UI/ml.

• -IgE sérica específica para D. pteronyssinus: se utilizó el radioinmunoensayo en fase sólida (RAST)30. Para capturar la IgE específica, en tubos de plástico, sueros testigos y problemas se incubaron durante 24 horas en heladera con discos de papel de filtro sensibilizados mediante uniones covalentes con antígenos del ácaro D. pteronyssinus (Cypress Diagnostics, Hulshout, Bélgica). Luego de lavar cuidadosamente los discos, se agregó un monoclonal anti-IgE marcado con yodo 125 (Siemens Healthcare Diagnostics, CA, USA) y se repitió el tiempo y temperatura de la primera incubación. Luego de los lavados de rigor, se leyó la radiactividad expresada en cpm en un contador de pozo gamma. Las lecturas de los sueros testigos permitieron por comparación la clasificación de los sueros problemas. En todos los ensayos se procesaron 5 testigos de concentración conocida de IgE específica para el ácaro en estudio, lo cual permitió graduar la positividad en: normal (0 PRU), ± (0,1-0,4 PRU), + (0,5-1 PRU), ++ (1,2-2 PRU), +++ (2,1-3 PRU), ++++ (> 4 PRU).

 

CUANTIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINA A

SALIVAL (IgAs)

• IgAs total: para el dosaje de IgAs en saliva se utilizó la técnica de IDRS29. Se siguió el procedimiento ya descripto en el dosaje de inmunoglobulinas, utilizando en este caso un antisuero policlonal anti cadena pesada alfa. Como testigo se utilizó un estándar de IgA sérica monomérica (Rockland, PA, USA). La IgAs es una molécula dimérica lo cual plantea una asimetría con el testigo, esto se corrige multiplicando la concentración de IgAs obtenida por un factor de corrección ya descripto previamente31y que en este trabajo tuvo un valor de 2,5.

• IgAs específica para D. pteronyssinus: para la detección de IgAs específica para D. pteronyssinus se utilizaron kits comerciales de ELISA de captura en fase sólida (Human Allergen Specific IgA ELISA Assay) de Diagnostic Automation, Inc (CA, USA) siguiendo las instrucciones provistas por el fabricante. Las determinaciones se realizaron con muestras de saliva diluidas 1:15. Los resultados de IgAs específica para D. pteronyssinus en cada paciente se expresaron como el cociente entre las unidades de densidad óptica (DO) obtenidas en el ELISA y los mg de IgAs total.

 

Análisis estadístico

Se calculó la media y el desvío estándar (DE) para las concentraciones de IgG, IgA e IgE séricas, y de IgAs para ambos grupos. Los mismos cálculos fueron realizados para determinar porcentajes y valores absolutos de poblaciones leucocitarias y subpoblaciones linfocitarias. Dichos valores fueron evaluados utilizando diferentes pruebas (Student, Mann-Whitney y Spearman), considerando una p<0,05 como estadísticamente significativa.

 

Resultados

 

Demografía. Los valores demográficos para los dos grupos de pacientes fueron semejantes. El grupo atópico (A) estuvo constituido por 25 individuos (15 varones, 10 mujeres) y el grupo no atópico (NA) formado por 22 individuos (12 varones, 10 mujeres). Las edades media, las desviaciones estándar (DE) y los rangos de edad de los individuos pertenecientes al grupo A y al grupo NA fueron: 8,92±2,48 años (rango: 6-12) y 8,13±1,9 años (rango: 6-13), respectivamente.

Diagnóstico. Luego de la realización de anamnesis, del examen físico y de prick tests se generaron dos grupos de estudio. Los pacientes NA tuvieron todos los prick tests negativos mientras que los pacientes A tuvieron prick tests positivos solamente para D. pteronyssinus. La Figura 1 muestra los valores de tests cutáneos para dicho alérgeno en ambos grupos. El grupo A estuvo formado por 22 casos de asma/rinitis y 3 de rinitis; y en el grupo NA hubo 12 casos de asma/rinitis, 1 de asma y 9 de rinitis.

Estudios in vitro. Todos estos estudios se realizaron el mismo día utilizando diferentes muestras biológicas (sangre entera, suero y saliva) que fueron recolectadas como se indicó en materiales y métodos, luego de comprobar ausencia de cuadro febril, resfrío o infecciones.

Recuento de glóbulos rojos y valores hematimétricos. Los valores de glóbulos rojos, plaquetas, y otros parámetros hematimétricos estuvieron comprendidos dentro de los valores de referencia para dicho grupo etario y fueron similares entre el grupo NA y el grupo A.

Determinación de poblaciones leucocitarias. Como se puede observar en la Tabla 1, el recuento total de glóbulos blancos demostró valores normales (absolutos y porcentuales) para ambos grupos. Entre las subpoblaciones leucocitarias solo se observó un aumento significativo en el porcentaje de eosinófilos en el grupo A (p=0,008). Los valores normales de leucocitos totales, neutrófilos, monocitos y linfocitos en todos los individuos del estudio indican la ausencia de procesos infecciosos al momento de la recolección de muestras.

Determinación de subpoblaciones linfocitarias. El estudio de subpoblaciones linfocitarias fue realizado mediante FACS. Los valores hallados (porcentajes y valores absolutos) para linfocitos T totales, subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+, y la relación CD4+/CD8+, así como los valores de linfocitos B totales arrojaron resultados normales para individuos de estas edades y no hubo ninguna diferencia para todos esos resultados entre el grupo A y el grupo NA (Tabla 2).

Cuantificación de inmunoglobulinas IgG e IgA en suero. Las concentraciones de IgG e IgA en suero estuvieron dentro del rango de normalidad para niños de estas edades en ambos grupos estudiados. En el grupo NA los valores de media y DE para IgG e IgA fueron de 924±198 mg% (rango: 651-1226) y 178,4±42 mg% (rango: 98-235), respectivamente, mientras que en el grupo A los valores de media y DE para IgG e IgA fueron de 909,2±174,3 mg% (rango: 662-1226) y 192,7±46 mg% (rango: 86-260), respectivamente. Como se observa en la Figura 2 al comparar las concentraciones de estas dos inmunoglobulinas entre los grupos NA y A, no se detectan diferencias con significación estadística entre ambas poblaciones.

• IgE sérica total. Las concentraciones de IgE sérica total fueron, como era esperable, significativamente mayores (p<0,0001) en el grupo A con respecto al grupo NA (394,4±183 UI/ml; rango: 208-980 versus 71,6±38,2 UI/ml; rango: 20-140, respectivamente).

• IgE sérica específica para D. pteronyssinus. Los valores de IgE específica de alérgeno fueron negativos (0 PRU) en todos los individuos pertenecientes al grupo NA, mientras que los pacientes pertenecientes al grupo A tuvieron valores positivos en un rango de 0,5 a 2 PRU. Hubo una correlación significativa (r=0,9; p<0,0001) entre los valores PRU y las concentraciones de IgE totales en el grupo A (Figura 3). También existió una correlación positiva entre los valores de prick y los de RAST ((r=0,7; p<0,03).

Cuantificación de IgAs total. Como se puede observar en la Figura 4A, los valores de IgAs totales fueron significativamente mayores (p=0,0015) en el grupo NA (24,54±5,98 mg%; rango: 14-34,5) que en el grupo A (18,86±5,69 mg%; rango: 10-35). Como controles negativos se utilizaron dos muestras de pacientes con déficit selectivo de IgA.

• IgAs específica para alérgenos (D. pteronyssinus). Para nuestra sorpresa, la cantidad de IgAs específica para D. pteronyssinus/mg de IgAs total fue casi dos veces mayor en el grupo de individuos A con respecto al grupo NA (1,921±0,42 versus 1,005±0,24; p<0,0001) (Figura 4B). De igual manera que para el estudio de IgAs total cuando se estudió la IgAs específica para alérgeno, se utilizaron como control negativo muestras de pacientes con déficit selectivo de IgA.

No hubo correlación significativa cuando se compararon los valores individuales de IgAs total con los niveles de IgE total, ni entre los valores individuales de IgAs específica para D. pteronyssinus e IgE específica para este alérgeno en el grupo de individuos A.

Determinación de subpoblaciones de linfocitos B. Los resultados obtenidos para el estudio por FACS de las subpoblaciones de linfocitos B se resumen en la Tabla 3. No hubo diferencias significativas entre los porcentajes de linfocitos B CD27y de linfocitos B CD27+ en ambos grupos. Las medias±DE fueron de 78,76±8,30 y 77,03±6,13 para NA y A, y de 15,15±6,98 y 15,69±5,58 para NA y A, respectivamente.

Alrededor de un 50% de los linfocitos B CD27+ totales fueron IgD+ (sin switch de Ig de membrana) y el otro 50% fueron IgD (con switch de Ig de membrana) en el grupo A como en el grupo NA (Tabla 3). La Figura 5 muestra un caso representativo de dichas subpoblaciones de linfocitos B.

Sin embargo, en el grupo A encontramos una disminución significativa con respecto al grupo NA en una subpoblación dentro de los linfocitos CD19+/IgD/CD27+. Dicha población tiene una muy intensa expresión de las moléculas CD27 y se la designa fenotípicamente como linfocitos CD19+/IgD/CD27+++. Los valores hallados fueron: 2,7%±0,5 en el grupo NA vs. 1,7%±0,6 en el grupo A (p=0,044). Un caso representativo de pacientes para ambos grupos se muestra en la Figura 6. La mayoría de estas células tienen un tamaño superior a los linfocitos convencionales cuando fueron medidos por FACS (datos no mostrados).

 

Discusión

 

El asma y la rinitis son enfermedades comórbidas que se asocian epidemiológicamente y también en su fisiopatología. Más del 80% de las personas con asma tienen rinitis, y esta última enfermedad constituye un factor de riesgo para el desarrollo de asma32. Porcentajes similares encontramos en nuestro estudio ya que en el grupo atópico (niños sensibilizados a D. pteronyssinus) el 88% de pacientes tienen asma y rinitis, mientras que en el grupo no atópico el porcentaje fue del 54%. Es importante recordar que este alérgeno es considerado uno de los principales factores etiológicos de asma/rinitis.

El diagnóstico correcto de estas dos enfermedades es muy importante para su adecuado tratamiento. El asma es un trastorno multifactorial complejo que involucra una variedad de diferentes mecanismos, con influencias genéticas y ambientales entrelazadas, lo que resulta en fenotipos clínicos heterogéneos. Debido a la complejidad y multiplicidad de los fenotipos de asma, no hay una única manera para la confirmación o la exclusión del diagnóstico. El diagnóstico se basa en una historia de síntomas respiratorios episódicos con obstrucción del flujo aéreo, combinado con hallazgos físicos, mediciones objetivas de la obstrucción de la vía aérea, y la reversibilidad. Para el diagnóstico de rinitis es muy importante una historia ambiental detallada, la detección de congestión nasal, prurito, rinorrea, estornudos; el patrón de dichos síntomas (estacional o perenne, intermitente o persistente); factores precipitantes; respuesta a los medicamentos anteriores; etc. Todos estos síntomas y signos fueron tenidos en cuenta durante el examen físico de los pacientes incluidos en este trabajo de investigación. Nosotros realizamos pruebas cutáneas no solo para confirmar el diagnóstico de asma/rinitis atópico33, sino para tener también indicaciones de los riesgos de padecer síntomas y sensibilizaciones como ha sido recientemente reportado en un gran estudio prospectivo de la Global Asthma and Allergy European Network34 .

En este trabajo de investigación las diferencias inmunológicas entre ambos grupos de pacientes y la confirmación de que uno de los grupos de niños con asma/rinitis era atópico (grupo A) se logró mediante estudios in vitro para valorar poblaciones leucocitarias, y el nivel y especificidad de anticuerpos tipo IgE. Las técnicas utilizadas para estos estudios han evolucionado desde que Pharmacia Diagnostics AB desarrolló el RAST en 1974 y en 1989 lo reemplazó por el InmunoCAP con un mejor límite de detección. Más recientemente, técnicas para cuantificar IgE de manera específica y simultánea para múltiples alérgenos recombinantes (Allergen microarray) han sido desarrollados y perfeccionadas35,36, y en el año 2013 la WAO-ARIA-GA²LEN publicó un documento de consenso el cual proporciona una guía práctica para las indicaciones, la determinación y la interpretación de los diagnósticos utilizando dichas metodologías para los médicos formados en alergología37 . Las ventajas y desventajas de este ensayo comparado con otras pruebas tanto in vitro como in vivo han sido recientemente evaluadas por expertos38.

Utilizando técnicas de radioimmunoanálisis para valorar IgE total y específica para D. pteronyssinus encontramos valores superiores a los límites de normalidad solamente en pacientes pertenecientes al grupo A. Hubo una excelente correlación entre niveles totales de IgE y niveles específicos de IgE para D. pteronyssinus, y entre los valores de prick y RAST para este alérgeno. Además, el grupo de niños A tuvo un aumento significativo de eosinófilos comparado con el grupo NA.

Aunque estas enfermedades no se pueden curar, la mayoría de los pacientes responden bien a tratamientos farmacológicos (reducción de la inflamación, control de los síntomas y prevención de exacerbaciones agudas)39,40; pero en otros pacientes las respuestas a los tratamientos son más heterogéneas y la enfermedad es más difícil de controlar41. Varias recomendaciones y revisiones sobre manejo de rinitis y asma se han publicado durante los últimos años42-44.

Además de los tratamientos farmacológicos existen otras herramientas terapéuticas para estas enfermedades, entre ellas podemos mencionar el tratamiento con un anticuerpo monoclonal humanizado IgG1 anti-IgE específico para el epítope que utiliza esta molécula para unirse a los receptores FcεRI y FcεRII45. Ha demostrado ser efectivo atenuando las respuestas tempranas y de fase tardía después de la exposición al alérgeno y la principal indicación es como complemento en la terapia de los pacientes con asma severo, aunque su uso es limitado por su costo46.

Sin embargo, el único tratamiento capaz de modificar la historia natural de asma/rinitis es la inmunoterapia específica de alérgeno (IT). Desde la primera publicación científica sobre este tema realizada en el año 191147, se ha avanzado tanto, que solo en los 2 últimos años existen 120 revisiones publicadas en revistas indexadas en PubMed. Como lo indican las siguientes revisiones, la IT es considerada en la actualidad una alternativa segura, eficiente y de larga duración para el tratamiento de asma, rinitis, dermatitis, alergia alimentaria en adultos y niños48-59.

La IT sublingual (ITSL) induce aumento de factores prorreguladores como la IL-10, TGF-beta e IFN gamma, disminución de IL-13 e IL-17, aumento de células T regulatorias, disminución de moléculas de adhesión en los endotelios, disminución de Th2, IgE y eosinófilos60. Si bien se ha demostrado que la IT induce isotipos de IgG bloqueantes para ciertos alérgenos61 no hay datos sobre el rol de IgAs en este tipo de terapia. Es importante destacar que esta inmunoglobulina es producida fundamentalmente en respuesta a antígenos que ingresan por mucosas62, y que por lo tanto su producción elevada podría tener efectos beneficiosos en ITSL.

Jutel M et al. estudiaron hace unos años la inmunidad de individuos normales al D. pteronyssinus y polen de abedul, y observaron una supresión de linfocitos periféricos Th1 y Th2 inducida por linfocitos T específicos de alérgenos que producían IL-10 y TGF-beta. Los autores mencionan en dicho trabajo que una situación similar ocurriría como consecuencia de la utilización de IT63. Esto implicaría que los individuos normales tienen a través de este mecanismo buenas cantidades de anticuerpos específicos para alérgenos tipo IgA y los individuos atópicos, no. Si bien TGF-beta induce la activación de células B y cambio de isotipo hacia IgA, sus efectos regulatorios pueden ser mediados por muchos otros mecanismos ya que esta citocina es muy pleiotrópica y se conoce que afecta a las células T, a la presentación de antígenos, a las funciones efectoras de los macrófagos, a la expresión de moléculas HLA de clase I y II, de CD40 e IL-12.

Aydogan M et al. estudiaron inmunoglobulinas séricas específicas para alérgeno en un grupo de niños con asma y un grupo de niños saludables, y observaron que los niveles de IgG1, IgG4 e IgE de pacientes asmáticos fueron significativamente mayores que en los controles sanos; y que la relación IgA/IgE fue menor en los enfermos. Además, los niveles séricos de inmunoglobulinas específicas de alérgeno fueron superiores cuando la duración de la enfermedad era superior a los cuatro años64.

Es interesante mencionar que en nuestro trabajo, si bien las concentraciones de IgAs totales fueron inferiores en el grupo de niños A, los niveles de IgAs específica para D. pteronyssinus fueron el doble en el grupo de individuos A con respecto al grupo NA. Esto claramente indica que los niños A no solamente producen cantidades elevadas de IgE específica sino que también tienen cantidades importantes de IgAs específica para el alérgeno.

Miranda et al. investigaron los niveles de IgE, IgG4 e IgA para D. pteronyssinus en muestras de niños alérgicos y en niños saludables, encontrando que anticuerpos IgA predominan en los niños no alérgicos, mientras que IgE e IgG4 son más frecuente en los niños alérgicos65.

Antes del advenimiento de CD27 como marcador general para los linfocitos B de memoria humanos, la expresión de IgD típicamente se utilizó para indicar la existencia de poblaciones de células B vírgenes, y la expresión de IgG e IgA evidenciaba una previa exposición a un antígeno y la existencia de linfocitos B de memoria. En 1990, Maurer et al. descubren una población de células B que expresan un marcador de células T, el CD27. Debido a que los linfocitos B CD27+ tienen mayor tamaño citoplasmático que los linfocitos B CD27, están en alta prevalencia en la sangre periférica de adultos pero no está presente en la sangre del cordón umbilical, y producen altos títulos de IgG después de ser estimulados, llevó a los autores a especular que estas células eran “preactivados”66,67. En 1998, dos publicaciones simultáneas demostraron que las células B CD27+, que también expresan CD148, tienen un gran aumento de mutaciones somáticas en los genes variables de inmunoglobulinas, lo que le dio más sustento a la idea de que este subgrupo de linfocitos B eran de memoria68,69.

En nuestro trabajo, cuando utilizamos un anticuerpo anti-CD27 para investigar estas dos subpoblaciones de linfocitos B no encontramos diferencias significativas entre los porcentajes de linfocitos B CD27-y de linfocitos B CD27+ entre ambos grupos de pacientes. Esta última población de células B representó 1/5 del total de los linfocitos B y aproximadamente la mitad de ellos fueron IgD+ (sin switch de Ig de membrana) y el otro 50% fueron IgD (con switch de Ig de membrana) tanto en el grupo A como en el grupo NA. Como se puede apreciar en todo nuestro trabajo, no hablamos de linfocitos B de memoria ya que no hace muchos años fue descubierto que las células B de memoria son heterogéneas y algunas de ellas son CD27. Por lo tanto, el antígeno CD27 es incapaz de caracterizar completamente todos los subconjuntos de células B de memoria, y algunas de estos linfocitos no expresan este marcador70.

Lo dicho anteriormente se refiere a las subpoblaciones de linfocitos B-2 (comúnmente llamados linfocitos B convencionales) pero no nos debemos olvidar de los linfocitos B-1 que en humanos expresan CD 27, pero se diferencian fenotípicamente de los linfocitos B convencionales CD 27+ porque son CD 43+71. Las células B-1 secretan anticuerpos naturales y juegan un papel crítico en la defensa contra la invasión microbiana, en la eliminación de los restos celulares, pero también regulan la expansión y diferenciación de células T72,73. Por lo tanto, para poder realmente caracterizar todas estas subpoblaciones de linfocitos B hay que utilizar FACS con dos láseres y anticuerpos no solo contra CD19, CD27 e Igs, sino también contra FCRL4, CD43 y CD70.

Interesantemente en nuestro estudio encontramos en el grupo A una disminución significativa con respecto al grupo NA de una subpoblación dentro de los linfocitos CD19+/IgD/CD27+. Dicha población tiene una muy intensa expresión de las moléculas CD27 y se la designa fenotípicamente como linfocitos CD19+ /IgD/CD27+++. Dichas células han sido definidas como linfoplasmocitos, y además de tener una alta expresión de CD27 también expresan CD3874.

Para concluir, podemos decir que a nuestro entender este trabajo es el primero que compara dos poblaciones de pacientes infantiles con asma y/o rinitis (en una población atópica y otra no atópica). Los otros trabajos que han estudiado isotipos específicos de inmunoglobulinas contra alérgenos han comparado poblaciones atópicas versus niños saludables. Nuestros resultados indican que el grupo de niños con asma y/o rinitis atópicos, si bien producen menos IgAs total que el grupo de niños con asma y/o rinitis no atópico, son capaces de producir no solamente altos niveles de IgE total y específica para el alérgeno, sino también IgAs específica para el mismo alérgeno al cual está sensibilizado. Estos resultados deberían hacer revisar el concepto de que, por lo menos para alérgenos inhalados, uno de los mecanismos propuestos por el cual la ITSL sería efectiva es a través de la generación de anticuerpos bloqueantes tipo IgAs contra el alérgeno, ya que estos pacientes tienen altas concentraciones de dichos anticuerpos.

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Autores

Horacio M Serra
CIBICI, Facultad Ciencias Químicas, UNC. Córdoba, Rep. Argentina.
Stefanía Santo
Laboratorio de Inmunología, Hospital de Niños de la Santísima Trinidad. Córdoba, Rep. Argentina.
María I Pereira
Laboratorio de Inmunología, Hospital de Niños de la Santísima Trinidad. Córdoba, Rep. Argentina.
Pablo Romero
Laboratorio Privado de Inmunología. Córdoba, Rep. Argentina.
Adriana Cassinerio
Laboratorio Privado de Inmunología. Córdoba, Rep. Argentina.
Telma Varela
División de Alergia e Inmunología Clínica del Hospital de Niños de la Santísima Trinidad, Córdoba. Rep. Argentina.
Omar Romero
Laboratorio Privado de Inmunología. Córdoba, Rep. Argentina.
Julio Orellana
División de Alergia e Inmunología Clínica del Hospital de Niños de la Santísima Trinidad, Córdoba. Rep. Argentina.

Autor correspondencia

Horacio M Serra
CIBICI, Facultad Ciencias Químicas, UNC. Córdoba, Rep. Argentina.

Correo electrónico: hserra@bioclin.fcq.unc.edu.ar

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IgE sérica e IgA salival, total y específica para Dermatophagoides pteronyssinus y subpoblaciones leucocitarias en niños atópicos y no atópicos con asma y/o rinitis

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Archivos de Alergia e Inmunología Clínica , Volumen Año 2015 Num 03

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Archivos de Alergia e Inmunología Clínica
Número 03 | Volumen 46 | Año 2015

Titulo
IgE sérica e IgA salival, total y específica para Dermatophagoides pteronyssinus y subpoblaciones leucocitarias en niños atópicos y no atópicos con asma y/o rinitis

Autores
Horacio M Serra, Stefanía Santo, María I Pereira, Pablo Romero, Adriana Cassinerio, Telma Varela, Omar Romero, Julio Orellana

Publicación
Archivos de Alergia e Inmunología Clínica

Editor
Asociación Argentina de Alergia e Inmunología Clínica

Fecha de publicación
11/2015

Registro de propiedad intelectual
© Asociación Argentina de Alergia e Inmunología Clínica

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