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Artí­culo Original

En época de medicina de precisión, para tratar asma neutrofílica, fibrosis pulmonar y artritis reumatoidea: naringina (¿o D´Artagnan? “uno para todos” *). Una mirada desde lo básico

S Cossy Isasi, S de Barayazarra, S Vanoni, RM Gómez, A Cazaux, M Ordoñez, JC Muiño

ARCHIVOS DE ALERGIA E INMUNOLOGÍA CLÍNICA 2024;( 03):0115-0119 | DOI: 10.53108/AAIC/202403/0115-0119


El asma es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias desencadenada principalmente por eosinófilos, basófilos, mastocitos y neutrófilos. El 50% de los casos pertenecen al fenotipo neutrofílico. La activación de neutrófilos implica la movilización de balsas en la membrana plasmática. La naringina (NGN), el glucósido natural de naringenina, tiene fuertes propiedades antiinflamatorias. Para saber si el efecto de NGN dependede una vía específica de señalización o de un proceso más inespecífico, simulamos cajas cúbicas con suspensiones de lípidos y con membranas enriquecidas con NGN, ambas construidas usando CHARMM-GUI, para probar la estabilidad estructural de y la miscibilidad de NGN en las membranas celulares . La composición de las membranas era palmitoil oleoil fosfatidilcolina (POPC), palmitoil oleoil fosfatidiletanolamina (POPE) y palmitoil oleoil fosfatidilserina (POPS) en una proporción mol/mol de 2:2:4 eventualmente enriquecidas con esfingomielina (PSM) y colesterol (CHL) o NGN, gangliósido GM1 en 3:3:2 mol/mol. Determinamos la asociación de lípidos (moléculas más cercanas dentro de 5 Å) en dinámicas de 100 ns a 310 K y 1 atm con GROMACS 2023.2. PSM formó balsas con POPC y POPE. CHL asociado con PSM y aumento de la tensión superficial de la membrana. Cuando NGN reemplazó a CHL, se distribuyó aleatoriamente, disminuyó la tensión superficial y se asoció principalmente con POPC o en los límites POPC-PSM. En membranas con CHL, NGN ocupó parches sin CHL. NGN se asoció con el GM1 sin formar rafts. El tratamiento de neutrófilos con NGN podría perjudicar el proceso de señalización debido a la aleatorización de la distribución de PSM y GM1 en la superficie de la membrana.


Palabras clave: sma, activación de neutrófilos, NGN, naringina, actividad antiinflamatoria, balsas o rafts de membranas celulares.

Asthma is a chronic inflammatory disease of the airways triggered primarily by eosinophils, basophils, mast cells, and neutrophils. 50% of cases belong to the neutrophilic phenotype. Neutrophil activation involves the mobilization of rafts in the plasma membrane. Naringin (NGN), the natural glycoside of naringenin, has strong anti-inflammatory properties. To find out whether the effect of NGN depends on a specific signaling pathway or on a more nonspecific process, we simulated cubic boxes with lipid suspensions and with NGN-enriched membranes, both constructed using CHARMM-GUI, to test the structural stability of and miscibility of NGN in cell membranes. The composition of the membranes was palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine (POPC), palmitoyl oleoyl phosphatidylethanolamine (POPE) and palmitoyl oleoyl phosphatidylserine (POPS) in a mol/mol ratio of 2:2:4 eventually enriched with sphingomyelin (PSM) and cholesterol (CHL) or NGN, GM1 ganglioside in 3:3:2 mol/mol. We determined the association of lipids (molecules closest within 5 Å) in dynamics of 100 ns at 310 K and 1 atm with GROMACS 2023.2. PSM formed rafts with POPC and POPE. CHL associated with PSM and increased membrane surface tension. When NGN replaced CHL, it was randomly distributed, decreased surface tension, and was mainly associated with POPC or at the POPC-PSM boundaries. In membranes with CHL, NGN occupied patches without CHL. NGN partnered with GM1 without forming rafts. Treatment of neutrophils with NGN could impair the signaling process due to randomization of the distribution of PSM and GM1 on the membrane surface


Keywords: asthma, neutrophil activation, NGN, naringin, anti-inflammatory activity, cell membrane rafts.


Los autores declaran no poseer conflictos de intereses.

Fuente de información Asociación Argentina de Alergia e Inmunologí­a Clínica. Para solicitudes de reimpresión a Archivos de Alergia e Inmunologí­a Clí­nica hacer click aquí.

Recibido 2024-08-07 | Aceptado 2024-08-20 | Publicado 2024-09-30

Figura 1. Set 1. Secuencia temporal que muestra la evolución del sistema ternario agua W: ciclohexa...

Figura 2. a) Visualización del modelo de membrana plasmática POPC:CHL:Gm1 100:10:5 mol:mol:mol. CH...

Figura 3a. Modelo de membranas POPC (verde):POPS (gris):POPE (amarillo):PSM 2:4:2:3, visua...

Figura 3b. PSM (rojo) forma grupos y NGN (naranja) se distribuye aleatoriamente.

Figura 3c. NGN (naranja) y PSM (rojo) sobresalen del plano del fósforo.

*“Les Trois Mousquetaires” de A. Dumas:

“Todos para uno y uno para todos”

Introducción

El asma bronquial es una enfermedad respiratoria crónica que afecta a personas de todas las edades. Comúnmente implica inflamación crónica de las vías respiratorias y síntomas de magnitud variable con el tiempo, que incluyen disnea, opresión endotorácica y tos [1]. Tiene alta prevalencia y morbilidad y niveles considerables de mortalidad [2]. Según la Iniciativa Global para el Asma (GINA), “El asma es una enfermedad heterogénea, con diferentes procesos subyacentes. Los grupos distinguibles por factores demográficos, clínicos y/o fisiopatológicos a menudo se denominan “fenotipos de asma” [1]. De hecho, múltiples estudios han demostrado que varios subtipos de asma pueden reflejarse en las manifestaciones externas de la enfermedad, que se denominan “fenotipos” y pueden implicar, entre otros tantos, síntomas clínicos como inflamatorios característicos [3]. Sin embargo, dado que los fenotipos del asma no implican mecanismos fisiopatológicos subyacentes, el asma también se puede clasificar en subtipos conocidos como “endotipos” [4], que se basan en mecanismos fisiopatológicos específicos tanto a nivel celular como molecular [5-7]. Se reconoce que “muchas células y elementos celulares” desempeñan un papel en la patogénesis de la enfermedad. Granulocitos como los eosinófilos y los neutrófilos tienen parte en el proceso inflamatorio en el asma y el patrón de infiltración de granulocitos se puede utilizar para identificar diferentes fenotipos inflamatorios en el asma. Esta información es útil porque se relaciona con la respuesta al tratamiento, vías mecanicistas implicadas en la patogénesis de la enfermedad y riesgo de enfermedad futura [8]. Curiosamente, el fenotipo inflamatorio no parece estar relacionado con el control de síntomas. Generalmente, el asma eosinofílico EA suele representar una enfermedad más grave con hiperreactividad de las vías respiratorias y un mayor riesgo de exacerbación [9]. En cuanto al asma no eosinofílico NEA, consiste principalmente en asma neutrofílica, caracterizado por obstrucción de las vías respiratorias mal controlada y peor evolución [10, 11].Tradicionalmente, los neutrófilos, originados en células madre de la médula ósea sólo habían sido considerados como una especie de célula de inmunidad innata [12]. En este sentido, los neutrófilos juegan un papel importante en la eliminación de patógenos y de desechos celulares [13]. La migración y activación de los neutrófilos podría causar inflamación y sensibilización directa o indirecta. La inflamación causada por el propio sistema inmunológico es realmente importante para la solución de infección y la eliminación de patógenos. Pero la inflamación persistente en el sistema respiratorio frecuentemente conduce a algunas enfermedades como el asma, la EPOC y la fibrosis pulmonar.

Se han probado algunos productos biológicos como tratamientos para el asma grave, pero son escasos los tratamientos farmacológicos dirigidos al asma neutrofílica, la mayoría de los estudios clínicos no se han centrado en los neutrófilos, por lo que se requiere investigación dirigida a la inflamación mediada por estas células para dilucidar el tratamiento óptimo[14]. Una contribución importante que cada vez ha ido cobrando mayor relevancia es el estudio de flavonoides con propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. Naringenina y su glicósido naringina se destacan particularmente por su efectividad como anti-inflamatorios en ensayos in vitro, in sílico o in vivo, en sistemas experimentales de animales diabéticos, con fibrosis hepática y con artritis reumatoidea, así como acciones pro - estrogénicas en análogos de osteoporosis [15]. Si bien hay evidencia experimental en favor de vías de señalización específicas reguladas por estos flavonoides, la amplitud de sus efectos permite suponer un mecanismo más general. En estos sistemas los neutrófilos participan como desencadenantes de la inflamación. Los leucotrienos son potentes mediadores proinflamatorios producidos por células implicadas en la respuesta inflamatoria, particularmente los neutrófilos, tras la estimulación y activación de cPLA2α posterior al incremento de calcio intracelular. La activación va acompañada de redistribución de balsas de membrana (rafts) enriquecidas en monosialogangliósido GM1 y colesterol [16]. Si alguna molécula pudiese particionar a la membrana plasmática de los neutrófilos y pudiese desorganizar las balsas, sería razonable pensar que tendría un efecto inhibidor de la activación y consecuentemente sería antiinflamatoria. En este trabajo evaluamos in sílico los efectos de la incorporación de naringina sobre la estructura de la membrana plasmática y la posible formación de rafts.

Métodos

Hardware

Los diseños, así como los scripts de prueba fueron realizados y corridos en una computadora con Intel I5 4a generación, 8 GB de memoria RAM. Las corridas de minimización (para asegurar la fidelidad estructural de los modelos moleculares virtuales) equilibración (para que las moléculas tengan todas sus coordenadas sin superposición simulando la temperatura y presión deseadas) y producción (acá es cuando se da curso al desarrollo de las interacciones moleculares según las leyes de combinación química y la física newtoniana del movimiento de partículas) se corrieron en el centro de cómputo CCAD – Universidad Nacional de Córdoba (https://ccad.unc.edu.ar/), integrante de SNCAD – MinCyT, República Argentina. Todas las instancias se simuló un Sistema a presión de 1 atm y temperatura de 310 K para 100 ns (nanosegundos = 10-9 segundos).

Sofware

Simulamos cajas cúbicas con mezclas de ciclohexano (CYHE), naringina (NGN) y agua, suspensiones de lípidos monoméricos y con membranas imitando la composición lipídica de membranas plasmáticas aisladas de neutrófilos humanos, con o sin NGN. En todos los casos el medio fue solución 0,15 M de KCl. Se obtuvieron los diseños con software del servidor web CHARMM-GUI [17], y todas las simulaciones se ejecutaron con GROMACS v 2023.2 [18]. El campo de fuerza (que define la forma de nombrar cada átomo y las propiedades de los compuestos) fue Charmm 36 y las simulaciones fueron del tipo “all atom” (se resuelven las ecuaciones para movimiento e interacción de cada átomo del sistema) con el solvente modelado TIP3 (el agua se representa por 3 puntos) en todos los casos.

El primer conjunto de simulaciones se diseñó para probar el carácter anfipático de las NGN. Construimos cajas con un sistema ternario de W:CYHE:NGN en proporciones de 1:1:1 a 8:1,2:0,8 mol:mol:mol.

El segundo conjunto de experimentos virtuales se realizó para probar el comportamiento de NGN en un modelo simple de membrana plasmática con palmitoil fosfatidilcolina (POPC), gangliósido GM1 (este fue elegido porque la activación de los neutrófilos cursa con reclutamiento de parches de membrana con GM1 a la membrana plasmática) y NGN o colesterol (debido a la presencia de anillos hidrofóbicos en ambas moléculas) para probar si la NGN promovería o inhibiría la formación de balsas como lo hace el colesterol.

Finalmente, para probar la capacidad de esfingomielina de inhibir la activación de neutrófilos en presencia de naringina, ensayamos membranas POPC: palmitoil oleil fosfatilcolina (POPE), palmitoil oleil fosfatilserina (POPS) 2:2:4 relación mol:mol:mol (semejantes al lado interno de la membrana plasmática del neutrófilo) eventualmente enriquecidas con esfingomielina (PSM), colesterol (CHL) o NGN y gangliósido GM1 en 3:3:2 mol:mol:mol. Determinamos la asociación de lípidos (moléculas más cercanas dentro de 5 Å).

Resultados

En la primera serie de simulaciones del sistema ternario W: CYHE: NGN se pudo observar que NGN se comporta como una molécula anfipática ofreciendo sus anillos apolares al entorno enriquecido en CYHE y la porción glucídica al entorno acuoso. El sistema de proporciones 8:1,2:0,8 mol:mol:mol es de particular interés por su similitud con las proporciones calculadas extrapolando las proporciones de solvente acuoso (representado por W), lípidos (representados por CYHE), y NGN que resultan en sistemas biológicos con las dosis de NGN en que se documentaron los efectos antiinflamatorios. El sistema evoluciona a través de la autoagregación de CYHE y luego la agregación parcial de NGN que finalmente se mueve a los límites entre CYHE: W (Figura 1).

En la segunda serie de simulaciones el modelo de membrana plasmática POPC:CHL:GM1 100:10:5 mol:mol:mol permitió observar que la presencia de colesterol favorece la agregación o formación de rafts con la porción ceramida de GM1 determinándose una tensión superficial 49 mN/m (Figura 2a). En el caso del modelo POPC:NGN:GM1 100:10:5 mol:mol:mol, NGN se distribuyó aleatoriamente y no se agrupó con la porción de ceramida de GM1 provocando una disminución de tensión superficial a 43 mN/m (Figura 2b). Cuando simulamos membranas modelo POPC:POPS:POPE:PSM 2:4:2:3, se pudo determinar y visualizar que PSM se agrega excluyendo POPC. Es decir que PSM forma rafts al margen de POPC (Figura 3a). Esta organización se robustece cuando se incorpora CHL a la membrana observándose rafts de esfingomielina y colesterol. Finalmente, cuando CHL es reemplazado por NGN, la distribución de PSM y GM1 se aleatoriza y NGN hace protrusión por encima del nivel de los grupos fosfato de los fosfolípidos indicando que la membrana sufre fuertes re - arreglos estructurales (Figuras 3b y c).

Discusión

Una primera observación es que los sistemas construidos fueron estables durante el período de 100 ns, lo que se traduce en resultados confiables.

Las simulaciones del sistema W:CYHE:NGN muestran que el glicósido NGN tiene carácter anfipático como las sales biliares y compuestos semejantes y cuando se lo expone a un sistema en que tiene componentes hidrofóbico e hidrofílico va a tender a ocupar la región de interfase, sin un predominio de interacciones hidrofóbicas o hidrofílicas. Estas consideraciones son de importancia al considerar formas de administración en los animales de experimentación y excluyen los experimentos de administración oral dado que NGN es procesada por la flora bacteriana. En las simulaciones de POPC:CHL:GM1 100:10:5 mol:mol:mol se pudo lograr una evolución que llevó a la formación de rafts como ocurre en las membranas de células vivas, particularmente neutrófilos, los cuales pueden ser activados variando la estructura de la membrana secuestrando colesterol con el empleo de βciclodextrina [16]. El reemplazo de CHL por NGN, POPC:NGN:GM1 100:10:5 mol:mol:mol disminuyó la tensión superficial lo que permite suponer que NGN podría ser un disruptor estructural en membranas especializadas como las del neutrófilo. De esta manera, podría resultar en una actividad antiinflamatoria al impedir el proceso normal de transducción de cualquier señal de activación del neutrófilo o de otras células del sistema inmunológico. La presencia de PSM contribuye a la estabilización estructural de las balsas o rafts formados por la asociación de PSM,GM1 y CHL. El reemplazo de CHL por NGN, NGN adopta una distribución más aleatoria que CHL y se localiza en separación de fase entre los rafts de PSM y GM1 y el resto de los fosfolípidos.

En conjunto los resultados nos permiten afirmar que NGN podría integrarse a las membranas de células eucariotas en las condiciones de simulación. Esto es relevante al considerar el posible mecanismo de ingreso al citosol, que no necesitaría de un transporte específico. Una vez incorporada podría ser un disruptor estructural de las membranas plasmáticas de las células como los neutrófilos y en consecuencia oficiar de molécula antiinflamatoria debido al entorpecimiento de los procesos de señalización inherentes a la activación de las células inmunocompetentes.

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Autores

S Cossy Isasi
Cátedra de Bioquímica y Biología Molecular, Medicina, FCM-UNC Córdoba. Argentina.
S de Barayazarra
Profesora Asociada de Alergia Inmunología, HNC-FCM-UNC Córdoba. Argentina.
S Vanoni
Clínica Médica, Hospital San Roque FCM-UNC Córdoba. Argentina.
RM Gómez
FCS-UC. Salta Argentina.
A Cazaux
Ex Jefe de Sección Neumonología, actual Jefe de Servicio de Clínica Médica Hospital Rawson, Córdoba, Argentina.
M Ordoñez
Jefe de Servicio de Alergia e Inmunología Hospital Misericordia Nuevo Siglo.
JC Muiño
Ex Director Carrera Alergia e Inmunología, FCM-UNC Córdoba, Argentina.

Autor correspondencia

S Cossy Isasi
Cátedra de Bioquímica y Biología Molecular, Medicina, FCM-UNC Córdoba. Argentina.

Correo electrónico: secretaria@aaaeic.org.ar

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Archivos de Alergia e Inmunologí­a Clí­nica
Número 03 | Volumen 55 | Año 2024

Titulo
En época de medicina de precisión, para tratar asma neutrofílica, fibrosis pulmonar y artritis reumatoidea: naringina (¿o D´Artagnan? “uno para todos” *). Una mirada desde lo básico

Autores
S Cossy Isasi, S de Barayazarra, S Vanoni, RM Gómez, A Cazaux, M Ordoñez, JC Muiño

Publicación
Archivos de Alergia e Inmunologí­a Clí­nica

Editor
Asociación Argentina de Alergia e Inmunologí­a Clínica

Fecha de publicación
2024-09-30

Registro de propiedad intelectual
© Asociación Argentina de Alergia e Inmunologí­a Clínica

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