Figura 1. Imagen biomicroscópica de la córnea de un paciente con QCE grado 1.

Tabla 1. Niveles de citocinas en lágrimas (pg/ml/ng) cuantificados mediante la técnica de ELISA.

Figura 2. Imagen de MCF de la membrana basal y la capa de Bowman. A. Córnea normal (recuadro: secc...

Figura 3. Imagen de MCF de células dendríticas. A. Córnea normal. B. Grado 1 de QCE. C. Estadio a...

Figura 4. Geles representativos de gelatinasas, TIMP-1 y colagenase-2 de lágrimas de pacientes com ...

Figura 5. Análisis densitométrico de MMPs y TIMP-1 libre en lágrimas. Los niveles de MMPs y TIMP-...

Figura 6. Inmunohistoquímica de MMP-9 y -2 en córneas. A. Córnea normal inmunomarcada con anticu...

Figura 7. Diagrama representativo del inicio/perpetuación de la QCE.

Introducción

La queratopatía climática esferoidea (QCE) es una enfermedad bilateral degenerativa de la córnea humana, caracterizada por la aparición de un velamiento progresivo de sus capas más anteriores. En sus etapas iniciales (grado 1) se observan formaciones tipo gotas múltiples, diminutas y translúcidas, principalmente en el espacio subepitelial de las zonas limbocorneoescleral nasal y/o temporal. La opalescencia se extiende lentamente a lo largo del área interpalpebral, hacia el centro de la córnea, en forma de banda (grado 2), dando a la córnea una apariencia empañada. En esta fase, la agudeza visual puede estar moderada o severamente disminuida. Áreas pequeñas, ovaladas, o geográficamente bien delimitadas pueden observarse dentro de las zonas comprometidas. Con el avance de la enfermedad, varias gotas amarillentas grandes o vesículas aparecen en las áreas afectadas, algunas de ellas destacándose bajo el epitelio de la córnea (grado 3). En este estadio avanzado comienza a observarse la opacificación y fibrosis del estroma subyacente, apareciendo en algunos casos neo formación de vasos corneales [1-10]. Es de destacar que, en esta enfermedad, en la córnea queda una zona no afectada, ubicada desde el limbo hacia la conjuntiva.

La QCE ha sido denominada también queratopatía de Labrador [2], degeneración esferoidea de la córnea [6], distrofia nodular de Bietti, distrofia nodular en banda de la córnea [11], degeneración queratinoide de la córnea [12], entre otros, de acuerdo con sus características anatomopatológicas, presumible etiología, apariencia clínica, y ubicación geográfica.

Las causas son desconocidas hasta el momento, pero esta enfermedad afecta fundamentalmente a personas mayores de 40 años, que trabajan a la intemperie en medios rurales [13]. Esta enfermedad ha sido descripta utilizando biomicroscopía y, en algunos pocos trabajos, mediante estudios histológicos de biopsias de córnea, en regiones de África y Asia [3,9], Medio Oriente [3,7], Australia [2], península del Labrador en Canadá [14], Arkansas y Arizona en los Estados Unidos de América [5]. Ciertas similitudes se observan entre estas regiones, como aridez del suelo, poca nubosidad y falta de sombra por la escasez de vegetación arbórea, alta exposición a radiaciones solares ultravioletas, y vientos constantes que vehiculizan partículas de polvo, arena o hielo [1–3; 14–17]. Nuestro grupo de investigación describió una alta incidencia de QCE en el Departamento El Cuy, Provincia de Río Negro, República Argentina e investigó las alteraciones oculares de estos pacientes [18,19]. La naturaleza proteica de los depósitos corneales fue sugerida inicialmente por estudios histopatológicos [20] y estudios de vesículas grandes disecadas de pacientes, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida [21]. Kaji y cols. detectaron productos de glicosilación avanzados, utilizando anticuerpos contra n-carboximetil-l-lisina, en biopsias de córnea de pacientes con QCE [22. Más recientemente, nuestro grupo utilizó espectrometría de masa para investigar especímenes parcialmente enriquecidos en depósitos proteicos anormales de córneas con QCE, y logramos identificar 105 proteínas, varias de las cuales tienen potencial para la formación de agregados, y un conjunto de ellas fue detectado en los depósitos mediante inmunohistoquímica [23].

A pesar de los muchos años transcurridos desde el descubrimiento de la QCE, todavía no se conocen los mecanismos moleculares involucrados en esta enfermedad de la córnea humana. Por tal motivo decidimos realizar este trabajo, para investigar si se trata de una enfermedad alérgica y definir la participación de diferentes componentes inmunológicos en la inducción y/o mantenimiento de esta enfermedad.

Materiales y métodos

Individuos

Este estudio de investigación fue aprobado por el Consejo de Revisión Institucional de la Universidad Católica de Córdoba y el Comité Institucional de Ética en Investigación de Salud del Ministerio de Salud de la Provincia de Córdoba, Argentina. El estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki.

Se examinaron individuos con QCE (n=8) y controles sanos (n=12) de poblados del Departamento El Cuy en la provincia de Río Negro, e individuos sanos de la ciudad de Córdoba (n=10), en Argentina. Todos estos individuos fueron evaluados clínicamente (examen físico y anamnesis) y no tenían otras patologías oculares ni generales.

Exámenes oftalmológicos

A todos los participantes del estudio se les explicó el trabajo de investigación, y aquellos que decidieron participar en él procedieron a firmar el consentimiento informado. Luego se les realizó los siguientes exámenes: refracción, biomicroscopía, sensibilidad corneal, tonometría y oftalmoscopia binocular indirecta del fondo de los ojos, como se ha descrito anteriormente [19]. El segmento anterior de pacientes portadores de QCE y controles fue fotografiado con un fotobiomicroscopio (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania), y película fotográfica Fujichrome Sensia de 100 ASA.

Microscopía confocal in vivo (MCF)

Las capas superficiales de la córnea de algunos pacientes y controles fueron estudiadas utilizando MCF, prestando especial atención a las células dendríticas (CD), a los depósitos proteicos anormales y a los plexos nerviosos. Las córneas fueron investigadas con esta metodología como hemos descripto anteriormente (Tesis doctoral Thamara Cafaro, Mecanismos moleculares involucrados en la etiopatogenia de la queratopatía climática esferoidea, 2011).

Muestra biológica

De todos los individuos se obtuvo lágrima (20 μl), utilizando un microcapilar descartable, sin estimulación química o física. Estas muestras fueron inmediatamente congeladas a –80 ºC hasta el momento de su utilización para realizar diferentes estudios.

Ensayos

Citocinas lagrimales

Las citocinas IL-1β, IL-8, IL-2, IL-17, IL-4, IL-13 e IL-10 fueron cuantificadas mediante un equipo comercial basado en ELISA (Bio-rad, Países Bajos) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Cuantificación de proteínas y de niveles/actividades de MMP-2, -9, -8 y TIMP-1

Las concentraciones de proteínas totales se midieron en muestras de lágrima realizando una curva de calibración con albúmina sérica bovina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) como estándar. Los volúmenes de las muestras de lágrima se ajustaron para obtener la misma cantidad de proteínas para todos los ensayos. Las MMPs y TIMP-1 fueron medidos en las muestras de lágrimas mediante zimografía y Western blot como previamente ha sido descripto (Tesis doctoral Julio Urrets-Zavalía, Queratopatía Climática en Argentina, 2008).

Inmunohistoquímica (IHQ)

Botones corneales de dos pacientes con QCE y de un individuo sano provenientes de un banco de órganos fueron fijados en formalina, embebidos en parafina, cortados en secciones de 5 μm y montadas en portaobjetos. Las secciones fueron empapadas por primera vez en xileno para quitar la parafina, rehidratadas en alcoholes (100, 90, 80, y 70%), y tratadas durante 12 minutos a 37 ºC con pepsina (0,5% peso/vol), que contiene 0,1 M de HCl para recuperar la antigenicidad. Las muestras se lavaron con 10 ml de tampón fosfato 150 mM de solución salina, pH 7,4 (PBS), peroxidasa endógena fue bloqueada con 0,3% de H2O2 en metanol durante 22 min, seguido de un lavado en PBS y bloqueo con solución de albúmina sérica bovina al 0,1% en PBS durante 40 min. Las muestras se incubaron en una atmósfera húmeda, a 4 ºC durante toda la noche, con antisueros de cabra anti-MMP-2, -9 humanas (R & D Systems, Minneápolis, MN). Esto fue seguido por incubación por una hora con IgG porcina anti-IgG de cabra marcada con biotina, y finalmente complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC) por 45 min de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Vectastain, Burlingame, CA). El color fue desarrollado utilizando sustrato H2O2 y el cromógeno diaminobencidina 3,3-durante 3 min. IgG normal de cabra con una especificidad irrelevante se utilizó como control. La contratinción se realizó mediante hematoxilina durante 1 min, seguido por deshidratación de etanol y montaje. Los cortes fueron examinados usando un microscopio óptico (Nikon ACT-2U, AG Heinze, Tokio, Japón) con un aumento de 40x y 100x por dos investigadores en forma independiente y a ciegas, expresando los resultados como: (–), tinción negativa; (+), algunas áreas teñidas positivamente; (++), muchas regiones teñidas positivamente. Se tomaron imágenes con una cámara digital (Nikon vista DS-U, AG Heinze Inc., Tokio, Japón).

Análisis estadístico

Los valores de citocinas y los valores densitométricos correspondientes a los geles de zimografías y membranas de los Western blots fueron sometidos a la prueba de Mann-Whitney. Se consideró significativo un valor de p < 0,05.

Resultados

Demografía

Las edades media±DE de los individuos de este estudio fueron, para pacientes y controles del Departamento El Cuy, 69,88±8,838 años y 62,31±8,014 años, respectivamente. Las correspondientes a los controles de la ciudad de Córdoba, 67,4±5,6 años.

Identificación de anormalidades subepiteliales y recuento de células dendríticas in vivo.

La Figura 1 es un ejemplo representativo de una imagen de biomicroscopía de la córnea de un paciente con QCE grado 1 en donde se observan microgotas con turbidez temporal con la franja límbica no afectada y clara.

La MCF mostró, además de los depósitos proteicos y anormalidades en los plexos nerviosos sub basales, que el número de células dendríticas (CD) en el limbo corneal aumenta significativamente a medida que la enfermedad progresa (Figura 2). Como se puede observar en la Figura 3, la densidad de CD en la QCE grado 1 fue de 87±7 células/mm2; mientras que en los estadios moderado y avanzado (grados 2 y 3) las CD aumentaron a 101±7 células/mm2 y 237±8 células/mm2, respectivamente.

Cuantificación de citocinas en lágrimas

Se utilizó ELISA para estudiar un panel de citocinas representativas de la inmunidad innata y de los distintos tipos de inmunidad adaptativa, analizando si estas proteínas estaban presentes en el fluido lagrimal de pacientes y controles.

Como se puede observar en la Tabla 1, no se detectó IL-2, IL-17, IL-4, IL-13 ni IL-10 en QCE ni controles; sin embargo, los niveles de citocinas proinflamatorias IL-1β e IL-8 estuvieron significativamente aumentados en pacientes (p<0,005).

Caracterización y cuantificación de gelatinasas (MMP-2 y -9) en lágrimas

Bandas gelatinolíticas de pro-MMP-9 y pro-MMP-2 (92 y 72 kDa, respectivamente) fueron detectadas en ambos grupos (Figura 4A). Las actividades de MMP-9 y de MMP-2 fueron significativamente mayores en pacientes con QCE en relación con los controles no afectados (ambos p<0,001, Figura 5).

Caracterización y cuantificación del inhibidor de MMPs (TIMP-1) en lágrimas

Los Western blots mostraron la presencia de una banda intensa, de aproximadamente 28 kDa, correspondiente a TIMP-1 (Figura 4B). El valor medio de TIMP-1 libre fue menos de la mitad en los pacientes con respecto a los controles, p<0,05 (Figura 5).

Caracterización y cuantificación de MMP-8 en lágrimas

En la Figura 4C se pueden observar las dos bandas inmunorreactivas de las formas pro- y activa de MMP-8 (75 y 60 kDa, respectivamente), en muestras de lágrimas de ambos grupos. Ambas formas resultaron estar significativamente aumentadas en los sujetos controles en comparación con los pacientes (p<0,001, Figura 5). Además, los niveles de esta colagenasa-2 fueron 30 veces superiores, tanto en QCE como en controles, con respecto a los valores hallados en individuos sanos de un centro urbano (dato no mostrado).

Inmunohistoquímica de MMP-9 y -2 en córneas

En córneas normales, no se detectó tinción corneal para MMP-9 (Figura 6A). Sin embargo, en las muestras de QCE la mayoría de las células epiteliales de la córnea fueron positivas para MMP-9 (Figura 6B). Ni los depósitos ni sus bordes mostraron inmunorreactividad para MMP-9.

MMP-2 se expresó en niveles bajos a través del epitelio corneal, tanto en muestras de QCE como en las de los controles (datos no mostrados). En QCE los bordes de muchos depósitos se tiñeron positivamente con anti-MMP-2 (Figura 6C), pero no se observó ninguna tinción dentro de ellos.

Discusión

La córnea tiene dos características muy importantes: protege al globo ocular y, por ser transparente, permite el paso de la luz para que llegue a la retina. La radiación ultravioleta B (RUV-B) impacta en la córnea y otros componentes oculares [24] y es capaz de dañar diversos tejidos, por: a) fragmentación de proteínas y ADN; b) generación de radicales libres y c) peroxidación lipídica [25]. Los humanos disponemos de diferentes posibilidades para protegernos contra estos daños: Uso de lentes y sombreros para evitar la RUV sobre la córnea, e ingesta de alimentos ricos en vitamina C o AA, vitamina E y vitamina A.

El AA es sintetizado en el organismo de algunos animales a partir de la glucosa, mediante un proceso enzimático que involucra a la enzima l-gulonolactona oxidasa. Sin embargo esta enzima está ausente en la especie humana, el cobayo y algunas variedades de murciélagos y pájaros, por lo que todos estos animales necesitan ingerir AA para no tener déficit del mismo. El AA es transferido desde el plasma al humor acuoso y posteriormente al tejido corneal utilizando mecanismos de transporte y concentración muy sofisticados [26]. Los animales de hábitos diurnos tienen una concentración de AA en el epitelio corneal significativamente mayor que los animales de vida nocturna; por lo tanto, la concentración de AA en el epitelio corneal está íntimamente relacionada con la exposición a RUV [27,28]. La película lagrimal es capaz de proteger al ojo de diferentes maneras [29], y el AA es uno de los responsables de estos mecanismos. El AA en lágrima proviene de las glándulas lagrimales y también de células epiteliales corneales que son dañadas y lo liberan al medio [30].

Nuestro grupo ha descripto que la QCE es una enfermedad rural, con una incidencia del 12% en el Departamento El Cuy en la Provincia de Río Negro, que afecta a individuos cuya ocupación principal es el cuidado de ganado ovino a campo abierto durante gran parte del día y durante todo el año [18,19]. Esta región patagónica se caracteriza por un clima seco, ventoso, árido y suelo arenoso escasamente cubierto por arbustos pequeños. La carne de estos animales ha sido, casi exclusivamente, su principal fuente de alimento, lo que ha condicionado una deficiencia nutritiva parcial de ácido ascórbico (AA) durante toda la vida (manuscrito en preparación). Es de destacar que no hemos encontrado QCE en habitantes de otras regiones de Argentina con condiciones ambientales similares, pero que se protegen los ojos adecuadamente y sus dietas, al ser más variadas, contienen cantidades óptimas de AA (manuscrito en preparación).

Basándonos en nuestras investigaciones elaboramos la siguiente hipótesis sobre la etiopatogenia de QCE. En ciertos individuos genéticamente susceptibles (Schurr TG, Dulik MC, Cafaro TA, Urrets-Zavalia JA, Serra HM. Genetic background and climatic droplet keratopathy incidence in a population from Argentina. BMC Ophthalmology, Submitted February 2011) se produce una reacción de hipersensibilidad en la córnea a antígenos ambientales aún no definidos, en donde inicialmente participan componentes de la inmunidad innata y posteriormente ocurre extravasación de diferentes elementos celulares y moleculares desde los vasos limbares. Debido a que estas personas viven y trabajan en condiciones ambientales desfavorables para la superficie corneal (clima seco y ventoso responsable de la existencia de gran cantidad de partículas en el aire; ausencia de vegetación/sombra), y que tienen disminuidos los mecanismos protectores contra las radiación ultravioleta (RUV) (no utilizan lentes de sol ni sombrero, y tienen una disminución significativa de AA en la córnea), se produce la degradación de proteínas extravasadas desde los vasos limbares y la acumulación progresiva en capa de Bowman y estroma superficial.

En algunos trabajos experimentales donde se investigó la respuesta de córnea de animales a diferentes agresiones se observó la participación de diferentes citocinas y factores de crecimiento en una compleja red de células inmunes, epiteliales, y estromales [31-33].

Debido a que hasta ahora no se conocen las causas de esta enfermedad, consideramos importante investigar la participación de la inmunidad innata en la génesis de esta reacción de hipersensibilidad que observamos en algunos de los individuos de esta área de la Patagonia argentina. Además, decidimos estudiar MMPs debido a que dichas enzimas controlan procesos de degradación/reparación en la córnea y a que su producción está selectivamente controlada por citocinas proinflamatorias como IL-1 beta y TNF alfa, y por el inhibidor natural TIMP-1.

Nuestros estudios de MCF demostraron que en el estadio inicial de QCE se observan depósitos reflectivos puntiformes en la capa de Bowman que no afectan el plexo nervioso subepitelial, mientras que en grados 2 y 3 de la enfermedad hubo condensación de los depósitos subepiteliales y anormalidades en los nervios, lo que podría explicar la importante pérdida en la sensibilidad corneal observada en estos pacientes [19]. El número de CD limbares en QCE fue superior al reportado por otros autores en córneas normales [34,35] y fue aumentando de manera significativa a medida que la enfermedad progresaba de grado 1 a grado 2 y grado 3 (87 ± 7 células/mm2, 101 ± 7 células/mm2 y 237 ± 8 células/mm2, respectivamente). Este incremento en la densidad de CD explicaría la ausencia de depósitos proteicos en la zona límbica, los cuales serían eficientemente removidos por estas excelentes células fagocíticas. Un aumento de CD ha sido reportado en otros tipos de procesos inflamatorios en córneas humanas [36].

Si bien en lágrimas de pacientes y controles no había niveles detectables de IL-2, IL-17, IL-4, IL-13 e IL-10, las citocinas proinflamatorias IL-1β e IL-8 estuvieron significativamente aumentadas en las lágrimas de QCE. Los niveles incrementados de IL-1β son los responsables del marcado aumento de gelatinasas en los pacientes, mientras que el aumento de IL-8, quimioatractante de neutrófilos, contribuyó a la liberación por dichas células de los elevados niveles de MMP-8 encontrada en estos individuos. Nuestros resultados también muestran una disminución significativa de TIMP-1 libre (inhibidor natural de MMPs) en pacientes con QCE lo que potencia de manera manifiesta el accionar de las gelatinasas y colagenasas. En la Figura 7 se puede observar un diagrama que resume nuestros resultados y explica el inicio / perpetuación de la QCE. En otras enfermedades de la córnea también se ha observado una importante correlación entre citocinas inflamatorias y enzimas degradadotas de la matriz extracelular [37,38].

Muy recientemente en una excelente publicación, Echegaray J y Pérez V revisaron las investigaciones referidas a la interrelación entre componentes inmunológicos y el epitelio corneal y concluyeron que en la capa superficial de la córnea se amalgaman varias vías inmunorreguladoras que eficientemente modulan el microambiente de la mucosa ocular superficie, conjuntamente con estructuras vecinas como la conjuntiva y las glándulas lagrimales [39].

En el año 2001, en la revista Allergy, se publicó un position paper sobre nomenclatura alérgica, trabajo que fue encargado por European Academy of Allergology and Clinical Immunology (EAACI) y realizado por un grupo de profesionales [40]. Ese grupo de trabajo de la EAACI tuvo la ambiciosa y difícil tarea de definir enfermedades clínicas sobre la base de conceptos fisiopatológicos. Dicho documento propuso redefinir el término “hipersensibilidad’’ como síntomas y signos reproducibles, iniciados por la exposición a un definido estímulo, a una dosis tolerada por sujetos normales’’. Esta definición abarca fenómenos inmunológicos, así como no inmunológicos. Mientra que el término alergia, debe ser entendido de manera más restrictiva como una reacción de hipersensibilidad iniciada por mecanismos inmunológicos. En una carta al editor de la revista Allergy, el Dr. A.L. de Weck AL [41] manifiestan que estas nuevas definiciones propuestas por EAACI, tanto desde un punto de vista histórico como etimológico, representan precisamente lo contrario de lo que fue propuesto históricamente, ya que la palabra alergia, acuñada en 1905 por von Pirquet [42], hace referencia a una reacción cualitativamente diferente a una respuesta normal, sin estar obligadamente relacionada a procesos inmunológicos.

Teniendo en cuenta que el documento de la EAACI fue solamente una propuesta y no una obligación, nosotros estamos de acuerdo con lo mencionado por el Dr. A.L. de Weck en aquella oportunidad y consideramos que la QCE puede definirse como una enfermedad alérgica que solo se presenta en algunos individuos. Este trabajo de investigación demuestra que en esta enfermedad participan activamente algunos componentes inmunológicos y células del parénquima corneal. Además nuestros resultados proveen nuevas alternativas para el desarrollo de terapias preventivas para esta enfermedad utilizando inhibidores de IL-1β y/o gelatinasas.

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Participación de componentes inmunológicos en la etiopatogenia de la queratopatía climática esferoidea

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